Inleiding
Een van de meest bestudeerde biomaterialen binnen de tandheelkunde is hydroxyapatiet (HA), beschreven met de molecuulformule Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂. HA is een belangrijk mineraal in tand en bot, waar het remineralisatie van glazuur en botregeneratie mogelijk maakt. Van HA zijn verschillende vormen en groottes bekend. Ronde HA-nanodeeltjes zouden het gunstigst zijn bij klinische toepassingen. Deze morfologie en grootte (nano) verhogen namelijk het contactoppervlak en de capaciteit van de deeltjes om in de kleinste holtes door te dringen, wat ertoe leidt dat HA effectiever herstellende processen in gang kan zetten. Gedeeltelijke vervanging van de OH-groepen door fluoride-ionen, leidt tot fluorhydroxyapatiet (FHA). Deze toevoeging van fluoride verhoogt de mechanische en chemische stabiliteit van het mineraal. Vanwege deze voordelige karakteristieken zou FHA eveneens gebruikt kunnen worden als botregenerend materiaal.
De invloed van verschillende parameters in de HA-synthese op de eigenschappen ervan, is al uitgebreid onderzocht. Een voorbeeld hiervan is de invloed van de reactietemperatuur tijdens de synthese op de morfologie en grootte van de deeltjes. Volgens bestaande literatuur zou een hogere reactietemperatuur leiden tot grotere HA-deeltjes. Het effect van verscheidene syntheseparameters op de eigenschappen van FHA is minder onderzocht. Het doel van deze studie was om meer inzicht te krijgen in de invloed van de reactietemperatuur op de fysisch-chemische en biologische eigenschappen van FHA.
Methode
Voor het onderzoek zijn vier testgroepen vervaardigd: drie FHA-groepen en één HA-controlegroep. De synthese van de deeltjes heeft plaatsgevonden bij verschillende temperaturen middels de neerslagmethode. De FHA-deeltjes zijn gesynthetiseerd bij drie reactietemperaturen, namelijk kamertemperatuur (RT), 40°C en 60°C. Dit heeft geleid tot vier groepen: HA-RT, FHA-RT, FHA-40 en FHA-60.
Na het verkrijgen van de batches, is van elke groep een druppel vanuit de waterige dispersie genomen om deze vervolgens te bestuderen onder de scanning elektronenmicroscoop (SEM). De verkregen afbeeldingen van de SEM zijn geanalyseerd met ImageJ software. Hiermee is de morfologie en grootte van de gesynthetiseerde deeltjes bepaald. Hierna zijn de batches gevriesdroogd en gesinterd. De kristalliniteit van de deeltjes werd in beeld gebracht met röntgendiffractie (XRD) en de chemische structuur werd gekarakteriseerd met Fourier-transformatie infraroodspectrometrie (FTIR). Door gebruik te maken van deze twee technieken kon vervolgens worden vastgesteld of HA en FHA effectief waren gesynthetiseerd. Hierbij zouden de FHA-deeltjes bij een succesvolle synthese een substitutie vertonen van de hydroxylgroep naar fluoride. Tot slot is gebruik gemaakt van een cytotoxiciteitstest op osteoblastvoorlopercellen. Deze test zou inzicht geven in de mate van schadelijkheid van de verschillende FHA-groepen op levende cellen. Daarnaast kon met deze test ook de vergelijking gemaakt worden tussen de cytotoxiciteit van HA-RT enerzijds en dat van FHA-RT anderzijds.
De kwantitatieve resultaten uit de SEM-analyse en cytotoxiciteitstest zijn statistisch geanalyseerd door middel van one-way ANOVA, gecombineerd met de Tukey’s post hoc test. Hierbij werd een p-waarde ≤ 0,05 als statistisch significant beschouwd.
Resultaten
Figuur 1 toont de SEM-afbeeldingen van de vier testgroepen, waarop zichtbaar is dat alle gesynthetiseerde nanodeeltjes rond van vorm waren. De deeltjes van de FHA-RT groep waren significant groter (~550 nm) dan de FHA-deeltjes gesynthetiseerd bij een hogere temperatuur en de controlegroep HA-RT (~120–150 nm). De röntgendiffractiepatronen lieten voor alle vier de groepen scherpe pieken zien, wat erop wijst dat de gesynthetiseerde deeltjes kristallijn zijn. Daarnaast zijn verschuivingen in pieken gevonden voor de drie FHA-groepen, duidend op de aanwezigheid van fluoride in het kristalrooster. De FTIR-spectra van alle vier de groepen bevatten banden van PO43- groepen. Het spectrum van de HA-RT groep liet daarnaast banden zien voor OH-groepen. Bij de drie FHA-groepen waren de banden voor OH-groepen verdwenen en bevatten de spectra juist drie nieuwe banden, duidend op de inbouw van fluoride.Tot slot heeft de cytotoxiciteitstest geen significante verschillen aangetoond in het aantal levende cellen tussen de drie FHA-groepen. Uit de resultaten kon tevens vastgesteld worden dat nanodeeltjes uit de HA-RT groep en FHA-RT groep even cytocompatibel zijn.
Conclusie
Uit de resultaten van dit onderzoek blijkt dat de in deze studie gebruikte neerslagmethode succesvol is voor het verkrijgen van ronde FHA-nanodeeltjes. Een hogere synthesetemperatuur dan kamertemperatuur (40/60°C) leidt hierbij tot kleinere FHA-nanodeeltjes, waarbij geen verdere morfologische en cytotoxische effecten zijn gevonden. Bovendien lieten de cytotoxiciteitsniveaus geen verschil zien tussen de HA-RT en FHA-RT groepen. Vanwege hun grootte en cytocompatibiliteit, zouden FHA-nanodeeltjes gesynthetiseerd bij een hogere temperatuur mogelijk gunstig kunnen zijn voor toepassing binnen de tandheelkunde.
Discussie
Het doel van deze studie was bij te dragen aan de kennis over fluorhydroxyapatiet, door de invloed van reactietemperatuur op de fysisch-chemische en biologische eigenschappen van FHA te onderzoeken. Hoewel dit onderzoek verschillende onderdelen bevat om deze informatie te verkrijgen, zijn er ook beperkingen binnen het onderzoek. De XRD- en FTIR-analyses zijn een bevestiging van een succesvolle HA- en FHA-synthese. In deze studie is echter geen aandacht besteed aan de exacte hoeveelheid ingebouwde fluoride. Het fluoridegehalte zou effect kunnen hebben op de oplosbaarheid van het materiaal en de cytotoxiciteit, waardoor vervolgonderzoek hiernaar van waarde kan zijn. Daarnaast zijn de testen één keer uitgevoerd en moeten de conclusies daarom worden gesteld met gepaste voorzichtigheid.
Ronde FHA-nanodeeltjes gesynthetiseerd bij hogere temperaturen zouden vanwege hun gunstige grootte en kenmerken, zoals mechanische sterkte, chemische stabiliteit en het vermogen tot botregeneratie, wellicht toegepast kunnen worden als biomateriaal binnen de tandheelkunde. Het onderzoek toont daarnaast vooralsnog veelbelovende resultaten met betrekking tot de cytocompatibiliteit van de FHA-nanodeeltjes. Om meer inzicht te krijgen in de klinische uitkomsten, zou deze studie uitgebreid kunnen worden naar een ethisch goedgekeurde in vivo studie.