Inleiding
Kwaadaardige tumoren die ontstaan in bot of uitzaaien naar bot zijn levensbedreigend. Veelal is een operatie de aangewezen behandeling om de tumor te verwijderen. Daarbij kunnen kankercellen achterblijven die naderhand opnieuw tumoren kunnen gaan vormen, waardoor een operatie dikwijls wordt gecombineerd met radio- of chemotherapie. Als gevolg van de operatie ontstaat een botdefect dat vervolgens gereconstrueerd dient te worden met lichaamseigen bot of een botvervangend materiaal (botsubstituut). Het combineren van medicijnen die worden gebruikt voor chemotherapie (cytostatica) met botsubstituten kan resulteren in de ultieme eliminatie van kankercellen die mogelijk achter blijven na de chirurgische verwijdering van bottumoren. Het doel van deze studie was om het botsubstituut Bio-Oss® te laden met cytostatica en te onderzoeken of de cytostatica vrijkomen en effectief zijn tegen kankercellen.
Materiaal & methode
In dit in vitro onderzoek zijn twee soorten cytostatica gebruikt, namelijk cisplatine en platina-bisfosfonaat (Pt-BP). Beide medicijnen zijn platinaverbindingen waarvan het platina-atoom bindt aan DNA, hetgeen leidt tot DNA-schade en uiteindelijk apoptose van de (kanker)cel. Cisplatine wordt reeds veertig jaar ingezet voor de behandeling van allerlei kankersoorten en Pt-BP is een experimenteel medicijn met een zeer hoge affiniteit voor botmineraal. Bio-Oss® is het meest gebruikte tandheelkundig botsubstituut voor de regeneratie van botdefecten in het orofaciale gebied.
Allereerst is in het (1) adsorptie-experiment onderzocht in welke mate de beide cytostatica binden aan Bio-Oss®. Gelijke hoeveelheden Bio-Oss® zijn daarvoor 24 uur lang in oplossingen met een van beide cytostatica gebracht, waarna de hoeveelheden niet-geadsorbeerd medicijn zijn bepaald. In het (2) afgifte-experiment is de medicijnafgifte van (met cisplatine of Pt-BP) geladen Bio-Oss® over een periode van 28 dagen bestudeerd door periodiek de afgegeven concentraties cytostaticum te meten en de oplossingen te verversen.
Het kankerceldodend effect van deze cytostatica is onderzocht in het (3) indirecte celkweek experiment. Humane borst- (MDA-MB-231eGFP) en prostaatkankercellen (PC3) zijn gebruikt, die bekend staan om uit te zaaien naar bot. Deze kankercellen zijn gekweekt in aanwezigheid van (door Bio-Oss®) afgegeven cytostaticum. Als negatieve en positieve controles zijn respectievelijk dezelfde cellen gekweekt in afwezigheid van cytostaticum en in aanwezigheid van ‘vers’ cytostaticum (cisplatine of Pt-BP dat niet is opgenomen en afgegeven door Bio-Oss®). De levensvatbaarheid van de cellen is na 1, 4 en 7 dagen kwantitatief bepaald (middels CCK-8 analyses). Daarnaast zijn dezelfde kankercellen in het (4) directe celkweek experiment gekweekt op het oppervlak van (met cytostaticum) geladen Bio-Oss®. De levensvatbaarheid van de kankercellen is op dag 1 en 4 kwantitatief bepaald (middels CCK-8). Op dag 4 is tevens het aantal levende kankercellen kwalitatief onderzocht door de celkernen van de kankercellen blauw te kleuren (met behulp van de fluorescerende kleurstof DAPI). Als negatieve controle zijn de kankercellen direct gekweekt op Bio-Oss® dat geen cytostaticum heeft gebonden.
Resultaten
Uit het adsorptie-experiment blijkt dat beide cytostatica in aanzienlijke concentraties worden gebonden door Bio-Oss®. Significant meer Pt-BP (95,59 μg/mg Bio-Oss®) wordt gebonden dan cisplatine (20,60 μg/mg Bio-Oss®; figuur A). Het afgifte-experiment toont aan dat beide cytostatica vervolgens beperkt worden afgegeven. Beide cytostatica laten een minimale initiële afgifte zien (<10% binnen 24 uur), waarna de afgifte vrijwel stagneert na 14 dagen. In de loop van 28 dagen is de totale afgifte van Pt-BP significant hoger (8,40 μg/mg Bio-Oss®) dan de totale afgifte van cisplatine (6,89 μg/mg Bio-Oss®; figuur B).
De indirecte celkweek toont een adequaat en concentratie-afhankelijk kankerceldodend effect van de afgegeven cisplatine en Pt-BP op borst- en prostaatkankercellen aan (figuren C-F). In de directe celkweek is de levensvatbaarheid lager (4,0-17,4%; figuren G, H) dan in de indirecte celkweek. Een deel van de gebonden cytostatica wordt namelijk niet afgegeven en blijft achter op het oppervlak van Bio-Oss®. De kankercellen die direct zijn gekweekt op geladen Bio-Oss® kunnen zowel in contact komen met afgegeven cytostaticum (in het kweekmedium) als met cytostaticum dat gebonden blijft aan het oppervlak. In de fluorescentie opnames van het directe celkweek experiment zijn aanzienlijk minder celkernen (van de kankercellen) aanwezig en dus in leven op cisplatine of Pt-BP gebonden Bio-Oss® ten opzichte van ongebonden Bio-Oss® (figuur I).
Discussie
Deze in vitro studie toont dat Bio-Oss® cisplatine en Pt-BP bindt en voor een deel weer afgeeft, terwijl het kankerceldodend effect van de onderzochte cytostatica behouden blijft. Uniek aan deze studie is het gebruik van het xenogene (van runderen verkregen) botsubstituut Bio-Oss® dat traag wordt geresorbeerd door het lichaam1. Niet gebonden met cytostatica vormt Bio-Oss® in vivo een matrix waarlangs osteoblasten bot af kunnen zetten, waarmee de regeneratie van bot wordt gefaciliteerd (osteoconductie)1. Het is zeker denkbaar dat het osteoconductieve vermogen van Bio-Oss® verandert als het wordt geladen met cisplatine of Pt-BP. De werking van platina-bevattende cytostatica is afhankelijk van het stadium van de celcyclus waarin platina door kan dringen in de celkern. Sneldelende kankercellen doorlopen dit stadium van de celcyclus sneller en vaker dan lichaamseigen cellen, hetgeen ze vatbaarder maakt voor deze cytostatica. Bij systemische toediening van de conventionele platina-bevattende chemotherapieën kunnen er ernstige bijwerkingen (o.a. gehoorverlies en niertoxiciteit) optreden, waar deze medicijnen ook berucht om zijn. Lokale afgifte van een cytostaticum via een botsubstituut verhoogt de beschikbaarheid in aangetast (bot)weefsel en beperkt ongewenste, systemische effecten. Tegelijkertijd kunnen hoge lokale concentraties leiden tot aantasting van omliggend gezond (bot)weefsel2. Eerdere pogingen om andere biomaterialen (in casu botcementen) te combineren met cytostatica zijn tot dusver (nog) niet succesvol gebleken door tekortkomingen in de materiaaleigenschappen, waaronder een te snelle desintegratie van het biomateriaal en een te snelle afgifte van cytostaticum met als gevolg een verstoorde osteogenese3. Pt-BP is recent in vivo minder toxisch gebleken dan cisplatine4, en vertoonde in ons onderzoek een relatief hogere binding aan en lagere afgifte van Bio-Oss®, doordat de botbindende bisfosfonaat-groep in dit medicijn sneller aan botoppervlak hecht. In vervolgonderzoek dient te worden opgehelderd wat het effect van (met cytostaticum) geladen Bio-Oss® is op de micro-omgeving van botweefsel en of geladen Bio-Oss® in vivo achtergebleven kankercellen kan elimineren na (gedeeltelijke) verwijdering van tumoren.
Conclusie
Uit deze in vitro experimenten blijkt dat Bio-Oss® geladen kan worden met cisplatine of Pt-BP om metastatische borst- en prostaatkankercellen te elimineren. Een botsubsituut dat tegelijkertijd kankercellen kan elimineren en regeneratie van botdefecten kan bevorderen heeft de potentie om ingezet te worden bij de operatieve verwijdering van bottumoren om de terugkeer van tumoren tegen te gaan.
Literatuurlijst
1 Schlegel AK, Donath, K. Bio-Oss® - a resorbable bone substitute? J Long Term Eff Med Implants. 1998;8(3–4), 201–9
2 Tahara Y, Ishii Y. Apatite cement containing cis-diamminedichloroplatinum implanted in rabbit femur for sustained release of the anticancer drug and bone formation. J Orthop Sci. 2001;6(6), 556–65.
3 Phull SS, Yazdi AR, Ghert M, Towler, MR. Bone cement as a local chemotherapeutic drug delivery carrier in orthopedic oncology: A review. J Bone Oncol. 2021;26:100345.
4 Nadar RA, Farbod K, Der Schilden KCV, et al. Targeting of radioactive platinum-bisphosphonate anticancer drugs to bone of high metabolic activity. Sci Rep. 2020; 10(1):5889.
Figuur
Hoeveelheid (A) gebonden en (B) afgegeven cytostaticum in μg per mg Bio-Oss®; levensvatbaarheid van de kankercellen gekweekt (C-F) in aan- of afwezigheid van (door Bio-Oss® afgegeven) cytostaticum en (G,H) op het oppervlak van (geladen) Bio-Oss®; (F) fluorescente opnames van borstkankercelkernen (aangegeven met witte pijlpunten) op (cisplatine of Pt-BP geladen) Bio-Oss® (vergelijkbare waarnemingen bij prostaatkankercellen, niet weergegeven); Gem. ± SD.; n=4 bij (1,2,3) en n=3 bij (4); * p < 0,05.
Breng je stem uit voor de publieksprijs!
Alle genomineerden voor de KNMT-GSK Bachelorscriptie Award 2021
