facebook

Freeze drying colloidal gelatin nanoparticles for bone regeneration: effect of cryoprotectants

De bachelorscriptie 'Freeze drying colloidal gelatin nanoparticles for bone regeneration: effect of cryoprotectants' van  L. Randoe, L de Ruiter en R. Mourad (Radboud Universiteit) is een van de genomineerden voor de KNMT Sensodyne Bachelorscriptie Award 2022. Op deze pagina kun je de samenvatting van hun scriptie lezen. Ook vertellen de Nijmeegse studenten over hun onderzoek en het belang ervan.

Inleiding

Als gevolg van trauma, parodontitis of fysiologische botresorptie kunnen er botdefecten ontstaan in het aangezicht die het lichaam niet zelfstandig kan repareren. Hierbij blijft voorspelbaar bot regenereren een uitdaging. De meest gebruikte techniek is tegenwoordig een autoloog bottransplantaat waarbij eerst een operatie nodig is om bot te oogsten, en vervolgens een om het transplantaat te plaatsen. Omdat dit nogal betrekkelijk is blijft de zoektocht naar biomaterialen die autoloog bot kunnen vervangen bezig.

Om te begrijpen waaraan een biomateriaal moet voldoen om geschikt te zijn voor bijdrage aan botregeneratie is het belangrijk om te snappen hoe botregeneratie werkt. Als bot beschadigd raakt vormt zich een hematoom, die wordt vervangen door een goed doorbloedde kraakbeenachtige matrix. Hierna gaan osteoblasten collageen produceren, waar hydroxyapatiet op neerslaat om zo bot te vormen. Echter, kan dat in het aangezichtsgebied lastig zijn, aangezien niet alle botten even goed doorbloed zijn, en er bij defecten als gevolg van resorptie geen hematoomvorming is die dit proces in gang zet.

Wat we met biomateriaal willen bereiken is deze kraakbeenachtige matrix simuleren, zodat osteoblasten zich daar kunnen nestelen en bot kunnen gaan produceren. Hiervoor zijn gelatine nanodeeltjes erg geschikt. Ze zijn namelijk in feite gemaakt van collageen, een biologisch afbreekbare stof. Verder creëren de deeltjes kleine ruimten waar de cellen in kunnen nestelen, ook kunnen er stoffen die botregeneratie stimuleren in de deeltjes worden ingesloten. Een laatste voordeel is dat door deeltjes te maken met tegengestelde oppervlaktelading de gel die gevormd wordt injecteerbaar is, maar de gel wanneer deze in situ is weer een stevige gel vormt. Zo is deze manier van botregeneratie dus minimaal invasief met een lager risico op infecties.

Wij hebben onderzoek gedaan naar verschillende cryoprotectants, die de nanodeeltjes beschermen tijdens het vriesdroogproces. Zo houden ze hun specifieke vorm en grootte. Hiervoor zijn suikers geschikt, omdat ze kristalliseren en gelatinedeeltjes inkapselen. Uit eerder onderzoek komen trehalose en sucrose naar voren als geschikte opties.

Methode

Als eerst moesten we gelatine-nanodeeltjes maken, deze hebben we met twee verschillende soorten gelatine gemaakt. Deze verschillende gelatinesoorten zorgden voor deeltjes met tegengestelde oppervlakteladingen. Dus hebben we twee aparte batches gemaakt, gelatine A deeltjes en gelatine B deeltjes. Deze hebben we gemaakt door de gelatine eerst op te lossen in water, en vervolgens druppelsgewijs alcohol toe te voegen. Gelatine kan niet in water oplossen, dus zorgde de alcohol ervoor dat de gelatine in kleine druppels in een suspensie raakt. Om deze kleine deeltjes te stabiliseren wordt een crosslinking stof toegevoegd. Dan is de suspensie klaar om de te onderzoeken cryoprotectants toe te voegen in twee verschillende concentraties. Ook hebben we aan een groep aceton toegevoegd als positieve controlegroep, en aan eentje alleen water als negatieve controlegroep. Hierna hebben we alle batches gevriesdroogd.

Nu was het natuurlijk belangrijk om te kijken wat de effecten van de cryoprotectants zijn, dat deden we door de gevriesdroogde deeltjes te bekijken onder een elektronenmicroscoop. Ook losten we ze op zodat we de deeltjes kunnen meten met dynamic light scattering, wat ons een gemiddelde afmeting van de deeltjes gaf. Verder bekeken we de oppervlaktelading van de deeltjes, en of de deeltjes compatibel zijn met levende cellen.

Resultaten

Voor gelatine A en B waren de deeltjes uit de groep met aceton als cryoprotectant het grootste na het vriesdrogen. De deeltjes uit de groep met 15% sucrose als cryoprotectant waren het kleinst. De oppervlaktelading van de gelatine A deeltjes met aceton was het hoogst en de gelatine A deeltjes met alleen water was het kleinst. De deeltjes uit de 20% sucrose groep hadden de op een na grootste oppervlaktelading. De oppervlaktelading van de gelatine B deeltjes was ongeveer gelijk tussen alle groepen.

afbeelding 1 scriptie  L. Randoe, L de Ruiter en R. Mourad

Op de foto's is te zien dat de vorm van de deeltjes goed bewaard is gebleven. In de test groepen waaraan een suiker is toegevoegd als cryoprotectant, is te zien dat de deeltjes zijn ingebed in een suikermatrix.

afbeelding 2  L. Randoe, L de Ruiter en R. Mourad

Voor gelatine A en B werd de hoogste absorptie gemeten door de ELISA reader voor de aceton groepen, de andere groepen waren allemaal ongeveer gelijk.

Conclusie

Uit de resultaten van dit onderzoek blijkt dat 20% sucrose de beste cryoprotectant is voor gelatine A deeltjes. Voor gelatine B deeltjes is er geen goede cryoprotectant gevonden. Geen van de suikers als cryoprotectant had een slechte invloed op de cel compatibiliteit.

Discussie

Voor gelatine A bleek uit de resultaten dat het toevoegen van 20% sucrose als cryoprotectant kleinere deeltjes oplevert in vergelijking met aceton. Aangezien aceton de positieve controlegroep was, was dit voor ons iets onverwachts. Dit is een erg gunstige uitkomst, aangezien er hierdoor een betere situatie is gevonden voor het vriesdrogen dan de huidige.

Voor gelatine B is er geen significant verschil gevonden tussen de deeltjes waar een suiker aan is toegevoegd en de deeltjes waar alleen water aan is toegevoegd. Het lijkt dus dat de suikers geen effect hebben gehad op de deeltjes. Wanneer we kijken naar de deeltjes in de groep met alleen water, is te zien dat ze erg goed uit elkaar liggen. Dat terwijl de gelatine A deeltjes met alleen water juist erg gefuseerd lijken. Een mogelijke uitleg hiervoor is dat de oppervlaktelading van de gelatine B deeltjes veel hoger is waardoor deze beter resistent zijn tegen het samenklonteren.

Uit het onderzoek naar de cel compatibiliteit blijkt dat er geen significant verschil is tussen de groepen met trehalose of sucrose als cryoprotectant en de positieve controlegroep. Dit was zoals we hadden verwacht. Wat ook uit ons onderzoek blijkt is dat de deeltjes met aceton een betere celgroei ondersteunen. Dit was een uitkomst die we niet hadden verwacht. Een verklaring hiervoor kan zijn dat de deeltjes geen aceton meer bevatten na het vriesdrogen. Dit is niet heel waarschijnlijk, aangezien de deeltjes met aceton voor een betere celgroei zorgden dan de positieve controlegroep.

Om klinisch gebruikt te worden, is er een cryoprotectant nodig die voor beide typen gelatine optimale resultaten geeft.

Terug naar het scriptieoverzicht 2022

KNMT Sensodyne Bachelorscriptie Award