Inleiding
Voor patiënten met een gespleten lip en gehemelte (CLP) is het cruciaal om littekenweefsel na een operatie te minimaliseren, omdat dit de spraak en de groei van de bovenkaak kan belemmeren. Twee eerdere studies in Nigeria en Indonesië hebben aangetoond dat het toedienen van honing na chirurgie een positief effect heeft op het verminderen van littekenweefsel bij CLP-patiënten. Honing is namelijk antimicrobieel, biedt voedingsstoffen en creëert een optimale omgeving tijdens de proliferatiefase en re-epithelialisatie bij wondgenezing. De exacte moleculaire en cellulaire mechanismen van honing in het verminderen van littekenvorming nog niet bekend en vormen daardoor de achtergrond van de onderzoeksvraag: kan honing het macrofaag fenotype beïnvloeden?
In dit onderzoeksproject is de mogelijke rol van honing in het moduleren van macrofaagfenotypes onderzocht. M1- en M2-macrofaag-subfenotypes spelen een cruciale rol in zowel de immuunrespons als de wondgenezing, waaronder littekenvorming. Deze macrofagen kunnen respectievelijk ontstekingen bevorderen of remmen. Wanneer ontstekingsstress langdurig aanwezig blijft in een wond, kan dit het afweersysteem overbelasten en de weefselschade verergeren, wat kan leiden tot pathologische wondgenezing en littekenvorming.
M1-macrofagen zijn ontstekingsbevorderende cellen die verantwoordelijk zijn voor het vernietigen van ziekteverwekkers en het mogelijk maken van ontstekingsreacties. Daartegenover staan M2-macrofagen, die ontstekingsremmende en genezende eigenschappen hebben en essentieel zijn voor snelle re-epithelialisatie, revascularisatie en fibroblastregeneratie. M2-macrofagen reguleren uiteindelijk het littekenproces door de vorming van littekenweefsel te remmen. Onder de microscoop vertonen deze twee fenotypes ook verschillende celvormen.
Verschillende signalen en cytokines kunnen het fenotype van macrofagen beïnvloeden, wat het interessant maakt om te onderzoeken hoe honing het macrofaagfenotype en zijn functies kan moduleren.
Hypothese
Het verbeterde wondherstel en de verminderde littekenvorming bij CLP-patiënten door honing wordt mogelijk gemedieerd door het bevorderen van ontstekingsremmende paden. We stelden dat de ontstekingsremmende effecten van honing gemedieerd worden door het bevorderen van een scheefgroei naar HO-1- en CD163-positieve ontstekingsremmende M2 macrofagen. Daarnaast stelden we dat honing de iNOS-positieve pro-inflammatoire M1 zou tegengaan.
Methode
Om deze hypothese te testen, werden verschillende concentraties Mesitran- en Manuka-honing evenals positieve controles toegevoegd aan muismacrofagen (RAW 264.7). Vervolgens werd een CCK-8 analyse (N=5) en qPCR (N=2) assay uitgevoerd om informatie te krijgen over de levensvatbaarheid van de cellen en de genexpressie van de verschillende specifieke markers. LPS werd gebruikt om de cellen naar het M1-fenotype te sturen, terwijl IL-4 werd toegevoegd om het M2-fenotype te sturen. Om te bepalen of een M1 cel is ontstaan, is de marker NO gebruikt. De marker CD163 verwijst naar het M2 celtype. Een morfologieanalyse werd uitgevoerd om de celvorm onder de microscoop te beoordelen. Voor de statische analyse om de levensvatbaarheid te bepalen is gebruik gemaakt van de Shapiro-Wilk test en de ANOVA. Voor het PCR experiment heeft geen statische analyse plaats gevonden.
Resultaten
De CCK-8-analyse toonde geen significante verschillen in cellulaire levensvatbaarheid tussen de controle met alleen medium en de cellen waar honing aan toegevoegd is. De morfologieanalyse onthulde geen dominante celvorm na behandeling met honing of positieve controles, wat aangeeft dat beide morfologieën aanwezig waren. Het RNA kon succesvol worden geïsoleerd van de behandelde macrofagen en er werd genexpressie waargenomen voor zowel iNOS als HO-1 in de honingbehandelde cellen.
Conclusie en aanbeveling
Honing heeft geen negatieve invloed op de levensvatbaarheid van macrofagen en bevordert de expressie van zowel pro-inflammatoire als anti-inflammatoire genen in vergelijking met de algemene controle. De genexpressie lijkt meer op die van LPS, hoewel met minder expressie, dan op die van IL-4. Er kon echter geen definitieve conclusie worden getrokken over de vorming van M2-macrofaagtypen, aangezien gegevens over de CD163-marker ontbraken. Wel kan geconcludeerd worden dat honing invloed heeft op de wondgenezing bij CLP-patiënten.
De resultaten laten zien dat honing het type macrofaag beïnvloedt om wondgenezing te verbeteren. Honing verhoogt de levensvatbaarheid van macrofagen en stimuleert de expressie van zowel pro-inflammatoire als anti-inflammatoire genen, wat kan bijdragen aan een verbeterd wondherstel. Aanvullende studies met grotere steekproeven en de validatie van extra markers, zoals CD206, worden aanbevolen om deze bevindingen verder te onderbouwen.
Discussie
Het onderzoek stuitte op enkele uitdagingen, zoals het geïnfecteerd raken van de cellen. Daarnaast konden we niet alle concentraties honing testen, vanwege een tekort aan materialen. Ook zijn er voor de morfologie analyse verschillende vergrotingen gebruikt, wat de interpretatie kan beïnvloeden. Het RNA-isolatieproces werd echter goed uitgevoerd. Verder werden er uitdagingen ondervonden bij de qPCR-analyse en de evaluatie van de genexpressie van macrofagen.